苹果酸

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聚苹果酸的发酵优化及提取pdf

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  硕士学位论文 摘要 聚苹果酸是一种以苹果酸为专一单体的完全生物可降解性高分子。聚苹果酸 的侧链上有很多游离的羧基,易于和氨基或羟基等基团毗连。聚苹果酸在药物载 体食物包装材料、吸水材料和化妆品等范畴有着主要的使用价值,并可用于制备 优秀的可降解塑料,以至能够取代石油来历的不克不及被生物降解的聚丙烯酸的短期 使用,具有着庞大的社会价值和贸易利润。虽然聚苹果酸有浩繁的长处,可是对 聚苹果酸的研究仍是较少的。在国外,对聚苹果酸的研究始于上世纪70年代, 可是它仅局限于化学合成的研究;而在国内,对聚苹果酸的研究也是2003年以 后才有一些报道,并且涉入不深。同化学合成法比拟,微生物发酵法制备聚苹果 酸具有所需的原料简单易得,产品较纯,反映前提暖和的劣势。但因为菌种的稳 定性和产酸能力的缘由,发酵法制聚苹果酸尚未构成财产规模。 论文在摇瓶培育基的根本上,改变氮源和微量元素等,优化得出了出芽短梗 霉BS04发酵产聚苹果酸的培育基构成。在摇瓶培育基的根本上应插手O.05%(体 积浓度)的玉米浆作为复合氮源,0.03%(质量体积浓度)的MnS04·H20、 经培育基的优化,聚苹果酸的产量达到了279/L。 论文对出芽短梗霉发酵产聚苹果酸的发酵罐培育前提进行了研究,确立了出 芽短梗霉发酵产聚苹果酸的培育前提。优化的培育前提为:4%的接种量,搅拌 培育体例,最佳的培育体例为:发酵起头时插手8%(质量体积浓度)的葡萄糖, 在残糖接近0时补料使发酵罐中的糖浓度为25ell,共补料两次,菌体耗损总的 葡萄糖为12%,此时聚苹果酸的产量可达到37∥L。 对发酵液中的聚苹果酸的测定、提取方式进行了初步的研究,获得了用无机 酸柱测定苹果酸的最优前提、从发酵液中提取聚苹果酸的提取方式及判定了出芽 短梗霉BS04发酵得出的聚苹果酸的成果及分子量。无机酸柱测苹果酸的前提为: 25Mm/L磷酸缓冲液、pH值为2.5,得出的苹果酸尺度曲线为: 方式为:以甲醇为沉淀剂,沉淀温度为4C,操纵多步沉淀法进行聚苹果酸的提 摘要 取。分手获得的的聚苹果酸经GPC测定分子量Mw为2490。 环节词 聚苹果酸出芽短梗霉补料培育提取优化 II ABSTRACT andabsolute akindof biodegradable Polvmalic polyester acid(PMLA)is ofthe acid.Onthesidechain PMLA,three L.malic whichis linked material only by aminoor of callbebondedwith group freedom hydroxyl are carboxyl,which many toforma linkothermolecules freedom Canalso bigger molecules.Thecarboxyl dmg canbe material.PMLA canbemadetomedical used觞capsule m01eCule,whiCh andcosmetic watermaterials product·It bio.materials,absorbent mal丽als.medical aswellas acidwhichCallbe aS poly-crylic alsobeused plastic can biodegradable has andcommercial PMLA muchsocial value.Although usedt0 oil.Soithas produce 011 the focused studieswere study,which advantages,few reported.Oversea many in1970’s.In on ofPMLAhas chemical started china,studyproduction synthesis,was to fermentation ofPMLA compared before2003.The by notbeen production reported andmore cost condition,lowerpollutions chemical Was lower,moderate synthesis andthe ofAureobasidium the ofPMLA stability dueto ability pure.But production industrialscale· hasnotform ofPMLAfermentation p“llulans,theproductionby thesis cultureWasstudied.This theculture flask Basedon medium,shake the traceelements source,adding thebasalmedium nitrogen optimized bychanging as acids.The mediummustcontain:0.05%(v/v)cornliquid and optimal organic and as撇e H3803 source,0.03%(m/v)MnS04‘H20、ZnS04’7H20 nitrogen fumaricacid.TheofPMLAwas elements.and acidand yield up 0.2%(m/v)succinic to onthe medium. 279/L optimal waS was ofthePMLAfermentation The condition investigated.PMLA 0ptimum reaction BS04infermenters.The Aureobasidium optimum by pullulans produced culturedfor PMLAis and conditionforthe of 240,3.5L/min,400r/min synthesis and inthemedium the of wasadded orderto PMLA,8%Glu 216h.In yield improve addedtomakesurethe to anotherGluWas whenthe Ginwent09,L remaining the WaS ofGlu in fermentation,4%Glu concentrationmaintaining259/L.During madethe ofPMLA to329/L. in improved addedtwice,whichyield nI fromfermentation andextractionofPMLA studiedthedetection nethesisalso columntodetectMLA from 85u this USe C-1 hydrolyzed brotll.In prevail paper,we in mobile were觞follows:25mM/L PMLA.The conditions KH2P04 chromatographic wasY= standardcurveofMLA ofmobile is2.5.The phase;thepH phase Wasused coefficientwas0.9994.Methanol correlation linear 0.0703X.0.0536.The PMLAafterthree of 4C.Weobtained precipitation· PMLAat just steps toextract were the solvents remaining Wasobtainedcollectingprecipitates,and PMLA by ofPMLAwas2490GPC. molecular removed weight by byevaporation.The Fedbatchcultivation; malicacid;Aureobasidium KEYWORDS pullulans Poly Extraction;Optimization IV 硕士学位论文 目 录 摘要··..·”·”·”··”··”·······”·””····”·······”·····”····I ABSTRACT······················································Ⅲ 第一章文献综述…………………………………………1 1.1聚苹果酸的性质及使用………………………………..1 1.1.1聚苹果酸的性质………………………………….1 1.1.2聚苹果酸的使用………………………………….2 1.2发酵法制备聚苹果酸的研究现状………………………….3 1.2.1概况…………………………………………..3 1.2.2出芽短梗霉的发酵………………………………..3 1.2.3 Physarumpolycephalum的非发展型无氮源培育…………4 1.2.4以出芽短梗霉(Aureobasidium 1.3生物体内PMLA的产朝气理及影响要素……………………..6 1.3.1无机酸对PMLA发酵的影响………………………….6 1.3.2葡萄糖浓度对PMLA发酵的影响………………………7 1.3.3接种量对发酵的影响………………………………7 1.3.4温度对发酵的影响………………………………..7 1.3.5溶氧对发酵的影响………………………………..7 1.3.6搅拌对发酵的影响………………………………..8 1.3.7 pH对发酵的影响…………………………………8 1.3.8泡沫节制对发酵的影响…………………………….9 1.3.9基质浓度对发酵的影响及补料节制……………………9 1.3.10概况活性剂对发酵的影响………………………….9 1.4聚苹果酸的提取方式…………………………………..9 1.4.1无机溶剂沉淀法…………………………………10 1.4.2膜分手法…………………………………j…..10 1.5聚苹果酸的定性与定量方式随3引………………………….11 目次 1.5.1酶法:………………………………………..11 1.5.2 L一苹果酸酶试剂盒法……………………………..13 1.5.3定量纸层析法…………………………………..13 1.5.4反相高效液相色谱法……………………………..13 1.5.5凝胶渗入色谱法…………………………………13 1.5.6核磁共振测定法:……………………………….14 1.5.7红外光谱法…………………………………….15 1.6本课题的研究意义和研究内容…………………………..15 1.6.1研究意义………………………………………15 1.6.2研究内容……………………………………...16 第二章聚苹果酸发酵培育基的优化…………………………17 2.1媒介………………………………………………17 2.2尝试材料与方式……………………………………..17 2.2.1菌种………………………………………….17 2.2.2培育基………………………………………..17 2.2.3仪器与设备…………………………………….17 2.2.4尝试试剂………………………………………18 2.2.5尝试与阐发方式…………………………………19 2.3成果与会商…………………………………………20 2.3.1分歧氮源对聚苹果酸发酵产量的影响…………………20 2.3.2玉米浆浓度对聚苹果酸发酵的影响…………………..21 2.3.3微量元素对聚苹果酸发酵产量的影响…………………21 2.3.4无机酸对聚苹果酸发酵的影响………………………22 2.4本章小结…………………………………………..23 第三章聚苹果酸发酵培育前提优化…………………………25 3.1媒介………………………………………………25 3.2尝试材料与方式……………………………………..25 3.2.1菌种………………………………………….25 3.2.2培育基………………………………………..25 硕士学位论文 3.2.3仪器与设备……………………………….……25 3.2.4尝试试剂………………………………………26 3.2.5尝试与阐发方式…………………………………26 3.3成果与会商…………………………………………27 3.3.1聚苹果酸发酵过程曲线……………………………27 3.3.2接种量对聚苹果酸发酵的影响………………………28 3.3.3搅拌对聚苹果酸发酵的影响………………………..29 3.3.4通气量对聚苹果酸发酵的影响………………………31 3.3.5温度对聚苹果酸的影响……………………………32 3.3.6分歧补料体例对聚苹果酸发酵的影响………….……..33 3.3.7溶氧对聚苹果酸发酵的影响………………………..36 3.4本章小结…………………………………………..38 第四章聚苹果酸的提取及判定…………………………….39 4.1媒介………………………………………………39 4.2L一苹果酸液相色谱测定方式简直立……………………….40 4.2.1流动相中无机盐品种的选择………………………..40 4.2.2无机盐浓度的选择……………………………….40 4.2.3流动相pH的选择………………………………..43 4.2.4苹果酸尺度曲线的制造……………………………45 4.3一步沉淀法…………………………………………45 4.3.1无机溶剂的选择…………………………………46 4.3.2无机溶剂量简直定……………………………….46 4.3.3 pH对提取率的影响………………………………47 4.3.4温度对提取率的影响……………………………..48 4.4分步沉淀法…………………………………………48 4.5产品分子量的测定…………………………………….49 4.5.1尺度曲线的绘制…………………………………49 4.5.2样品分子量的测定……………………………….49 4.6布局判定……………………………………….…..50 目次 4.7本章小结…………………………………………..5l 第五章结论与瞻望……………………………………….53 5.1结论………………………………………………53 5.2课题瞻望…………………………………………..54 参考文献…………………………………………………55 致 谢………………………………………………….59 硕士学位论文 第一章文献综述 聚苹果酸(PMLA)是一种以苹果酸(MLA)为专一单体的完全生物可降解性高 分子。PMLA次要有三种布局:Gt型、p型和丫型三种(见图1)E11,专一具有于生 物体内的只要p型,是目前研究的热点。PMLA能被某些微生物先降解为低聚物, 尔后构成苹果酸等单体,并最终降解为二氧化碳和水。PMLA的降解效率很快, 在菌体内几个小时就能被全数降解为单体。 . ,_}0 旷 C一 斗o_彳融c即艮 蛆 H 忐-严啪皑F咖淄 B型 +o—CH.cH2一oc朝r +o_CH.cH2一c110-王=_c韦 H00C1韦)c9iH军一o IrH2 .r型 图1.1聚苹果酸的三种布局 threekindsofPMLA Figl。1 到目前为止,聚苹果酸次要有两种方式合成,一种是化学合成,一种是生物 合成。化学合成的有三种构型,可是生物合成的只要p型。与化学合成比拟,生 物合成的聚苹果酸分子量较大。并且生物合成的还有原料简单和反映前提暖和等 长处【2】。 本文综述了PMLA及其衍生物的性质、微生物发酵合成方式以及提取阐发 阐发测定方式的研究进展。 1.1聚苹果酸的性质及使用 1.1.1聚苹果酸的性质 1.1.1.1物理性质 PMLA在常态下是一种白色粉状固体,因为分子大小纷歧,熔点和玻璃化温 度不定。从其布局能够看到,PMLA的侧基上含有大量的羧基,而羧基是一种较 强的亲水基团,因为具有这种特殊的布局使其具有较大的水溶性和吸水性【31,当 一部门羧基与不溶的物质连系后,聚合物在水中仍有~定的消融。 第一章文献综述 1.1.1.2化学性质 由短梗霉属菌株合成的聚苹果酸的2%“D水溶液的pH为2.0,酸性比聚 丙烯酸强。聚苹果酸的羧基可与碱中和构成一种高度水溶性的聚阴离子。聚苹果 酸与多价阳离子如质子化的精胺、聚乙烯亚胺、聚L.赖氨酸、庆大霉素、组蛋 白等连系成具有高亲和力的复合物。 1.1.1.3生物学性质 通过对黏菌中聚苹果酸的心理感化的研究,发觉聚苹果酸有分歧于作为能源 和碳源存储物质的功能。聚苹果酸与DNA复制型聚合酶、组卵白以及其它还没 判定的核卵白连系,因此推进多卵白复合体的构成。研究者们为了摸索聚苹果酸 的心理功能,已研究了其细胞特同性、细胞内的分派环境、它的体外反映以及显 微打针对变形体的影响,按照研究成果猜测,聚苹果酸的功能是作为分子载体和存 储安装来分派足够数量的卵白以满足细胞核增殖的需要。 1.1.1.4聚苹果酸的降解机能 PMLA主链上含有大量的酯键,在一些无机物(如酸)和酶的感化下能加水分 解,例如:在其水溶液中滴插手H2S04,高分子的PMLA能先降解为低聚物, 尔后构成苹果酸单体【4】。此外,因为其本身的酸性,在必然的高温下,能本身发 磷酸缓冲溶液中(pH=7.5),在分歧温度下水解,发觉当温度越高时,聚合物降 用下,PMLA先降解为小分子物,其后这些小分子物进入各类代谢路子【6】,酯键 的生物降解难易程度与肽键的生物降解相当,生物降解难易程度与聚合物的分子 G起首分手获得了PMLA 量大小、熔点、结晶度及所降解生物品种相关。Carolin 的降解菌株而且分手纯化了一种PMLA水解酶,从酸性土壤或腐臭的动物平分 布局类似,可是不异前提下口型PMLA的主链上每个单体比a型PMLA的主链 上每个单体多一个碳原子,所以13型生物降解性可能较a型和),型的强,即易降 解[91。 1.1.2聚苹果酸的使用 2 硕士学位论文 1.1.2.1作为药物载体及微胶囊材料【10】 PMLA具有生物相容性和生物可接收性,其降解产品无毒性[61,无抗原性, 也能够被人体接收操纵。对大分子前体药物的研究表白:小分子药物与高分子载 体连系后,具有缓释、长效、毒副感化小等特点,并能更好地阐扬小分子药物的 感化,因此具有很多小分子药物所无法对比的长处,并且羧基可与某些药物基团 中有毒侧链连系,降低药物带来的副感化。 1.1.2.2作为生物医学材料 因为PMLA及其衍生物也具有生物降解性及生物可接收性,它们能够作为 生物医学材料如手术缝合线、烧伤医治的绷带等,间接用于人体【IIJ。 1.1.2.3其他用处 PMLA具有较大的溶水性和吸水性,能够作为吸水材料【121利用也能够用作 为化妆产物【13】。并且,因为PMLA无毒性,还能够用在食物包装上。 1.2发酵法制备聚苹果酸的研究现状 1.2.1概况 最早报道产PMLA的菌株是Penicillium cyclopium[141,自从那当前就发觉了 很多产聚酯的菌株,如:Physarum sp[9], Aureobasidium 微生物合成PMLA的研究较少,分手获得的菌种也很少。生物发酵获得的产品相 对分子质量一般在几万。在发酵制备PMLA的菌种中,研究得比力多的是出芽 短梗霉系列。出芽短梗霉,又叫出芽茁霉,在分类上属于半知菌纲真菌。大都出 芽短梗霉菌株在发酵中都需要氧气【1920]。出芽短梗霉在其糊口史中具有酵母样和 线,这两种形态的构成受培育基成分、培育前提及各类要素 的影响,它们能够彼此转化。因为两种形态合成有用代谢产品的能力不刚221,在 短梗霉发酵过程中菌丝体形态的细胞是聚苹果酸的次要出产者[2223,24’2习。 1.2.2出芽短梗霉的发酵 常天俊,胡道伟等[261指出出芽短梗霉为好氧菌,在发酵过程中连结较高的溶 解氧浓度和氧传质系数是进行短梗霉发酵的环节。可是过低的DO值对菌体发展 和代谢产品的出产都晦气,过高的DO值使培育液中糖大部门耗损在菌体的发展 上,也晦气于代谢产品的出产。 第一章文献综述 王长海,宋振响掣20】在短梗霉30立升发酵罐研究时发觉短梗霉在发酵过程 中跟着发酵产品的不竭堆集,发酵液黏度不竭增大,以致于菌体供养遭到限制, 从而影响产品的合成。为了降服发酵罐的这个弱点,他们采纳了逐步添加搅拌速 度和通气量的方式进行发酵(当发酵至24小不时,别离从初始的250r/rain和 13L/min提高到500r/min和20L/min),将底物的转化率提高到56.37%。 出芽短梗霉属菌株可操纵D.葡萄糖、蔗糖、果糖、葡萄糖醇和琥珀酸为碳 源[3’271,所合成的聚苹果酸是以聚苹果酸.葡萄糖连系体的形式排泄的。操纵聚 苹果酸在丙酮中的高消融性除去毗连的葡萄糖,便可获得聚苹果酸。此外,还有 一些被培育液中的酶分化为分子量5,00011,000的自在聚苹果酸。目前, 以出芽短梗霉属菌株合成的聚苹果酸的产率较高。随菌株的分歧,产率在12∥ L【28】609/Lt3】的聚苹果酸钠盐或钙盐的范畴内变化。 1.2.3 Physarum polycephalum的非发展型无氮源培育 放到培育基中【291。 Lee等[30】以菌株Physarumpolycephalum发酵,发此刻无氮源的前提下,菌 体根基不发展,但PMLA的堆集很快;无机酸如苹果酸、富马酸的插手会遏止 菌体的发展,但菌体中PMLA的产量会添加。表白PMLA的出产不需要菌体的 发展,并且菌体的发展和聚苹果酸的发生合作葡萄糖作为碳源。尝试还表白:胰 化卵白胨对PMLA时有抑止感化的,并且浓度越高抑止感化越大;代谢两头产 物在2天后(发展期竣事)再加,对PMLA出产的刺激感化就会添加。 Lee等操纵菌株P细sarum 前提下发酵,比一般发酵时聚苹果酸的产量添加了50.65%。 1.2.4以出芽短梗霉(Aureobasidium puHulans)发酵出产PMLA 钠、乙酸和丁二酸钠别离作碳源发酵,发觉葡萄糖、蔗糖和丁二酸有益于获得 PMLA。以葡萄糖作碳源,发酵平分别添加三氟乙酸、丙二酸、马来酸、苹果酸 和丁二酸等无机酸,发觉苹果酸和丁二酸能较强的刺激PMLA的堆集,三氟乙 酸是抑止剂,丙二酸和马来酸的影响不大。同时他们以葡萄糖为碳源,硝酸钠为 4 硕士学位论文 酵约9天,发觉PMLA的发生次要是在对数期,产量与葡萄糖的含量成反比, 约15%的葡萄糖用于细胞的繁衍发展,约85%的葡萄糖用于出产PMLA。发酵 96小时之后pH值变得迟缓下降。通过尝试测得pH值在4.0时发生的聚合物的 发酵液中,通过破裂细胞,将所得的发酵液和细胞破裂液一路分手、提取能够得 到PMLA。经测定PMLA的产量达到9.89/L,葡萄糖的耗损约为889JL。 刘双江【31】以出芽短梗霉菌株CBS591.75和DSM2404发酵出产聚苹果酸,得 48小时前,虽然细胞有所增加,根基上没有聚苹果酸发生,此阶段内pH上升到 时里,细胞继续发展,pH迟缓下降,发酵液中聚苹果酸浓度成线性上升;第三 阶段,聚苹果酸浓度仍迟缓升高,pH趋于不变。尝试竣事时CBS591.75发生的 聚苹果酸浓度为6.99/L,葡萄糖耗损掉50%,干物质细胞产量139/L。相对而言, DSM2404发生的聚苹果酸量较少,最终产量为5.4 g/L,而葡萄糖耗损较多,72% 后发酵液中聚苹果酸的浓度为8.09/L。 1.2.5以氧化黑酵母筛选获得的菌株Aureobasidium sp发酵出产,8-PMLA Naoki N191等从氧化黑酵母筛选获得一种可以或许发酵出产PMLA的菌株 MgS04·7H20、柠檬酸、吐温80作为筛选培育基。以葡萄糖为次要碳源,丁二酸 玉米浸泡液作为种子培育基培育获得的最优的菌体发酵。以葡萄糖为碳源,丁二 基,通过插手CaC03调理发酵液的pH,节制温度在25℃,时间为7天,获得的 Ca.PMLA/L,PMLA的含量为 发酵液中聚苹果酸以钙盐的形式具有,约为619 中。 总的来讲,目前国表里的程度都不是很高,并且研究的也比力少,归结缘由 第一章文献综述 为:(1)聚苹果酸的发酵机理还不是很清晰。据Lee和Holler等讲聚苹果酸次要 是由L苹果酸聚合而来的,发生PMLA的L.苹果酸次要是通过丙酮酸羧化感化 和TCA轮回中草酰乙酸的氧化感化构成的,可是具体的还不是很清晰。(2)一 些两头代谢产品,如:苹果酸、富马安酸、琥珀酸、草酰乙酸等,会对聚苹果酸 的出产发生抑止感化。并且还有一些抑止剂或激活剂的感化也不是很清晰。(3) 聚苹果酸的次要出产菌出芽短梗霉菌的发酵机能比力复杂,在分歧的发酵情况中 发生分歧的发酵产品,如短梗多糖、黑色素等。因为以上的各种缘由,所以导致 了发酵产量比力低。目前,我们尝试室的摇床程度约为309/L,而7.5L发酵罐的 程度才是十几,这可能是因为前提还没优化好的缘由。所以,我的目标就是通过 培育基,培育前提,培育体例等的优化来提高发酵罐的产量。 1.3生物体内PMLA的产朝气理及影响要素 目前,对于生物体内PMLA的发生及堆集机理还不清晰,H。暗等[32】通细致 菌physarum PMLA,揣度PMLA的合成路线涉及柠檬酸轮回而不是丙酮酸羧化,同时发觉琥 珀酰辅酶A有益于PMLA雷同物的合成。三氟乙酸能够使柠檬酸合成酶失活, 是柠檬酸轮回和乙醛酸歧路的强抑止剂,而三氟乙酸能够抑止PMLA的发生, 这就显示了PMLA的合成与柠檬酸轮回和(或)乙醛酸歧路相关[331。从菌株 (physarum PMLA的侧基羧酸根显示负极性,酸根间的距离与DNA的磷酸之间的距离相当, 且这两种物质都为阴离子聚合物,所以都能够与同源的聚合酶卵白连系,即发生 合作性抑止【331。 1.3.1无机酸对PMLA发酵的影响 Lee等【30】以菌株Physarumpolycephalum发酵,发此刻无氮源的前提下,茵 体根基不发展,但PMLA的堆集很快;无机酸如苹果酸、富马酸的插手会遏止 菌体的发展,但菌体中PMLA的产量会添加,表白PMLA的发生与菌体量关系 蔗糖、乙酸钠、乙酸和丁二酸钠别离作碳源,发觉葡萄糖、蔗糖和丁二酸有益于 获得PMLA。以葡萄糖作碳源,发酵平分别添加三氟乙酸、丙二酸、马来酸、苹 果酸和丁二酸等无机酸,发觉苹果酸和丁二酸能较强的刺激PMLA的堆集,三 6 硕士学位论文 氟乙酸是抑止剂,丙二酸和马来酸的影响不大。在培育基中插手苹果酸和丁二酸 可以或许解除三氟乙酸对PMLA的抑止。在丁二酸的存鄙人,葡萄糖初始浓度为90 7.Sg/L。葡萄糖初始浓度为259/L时,丁二酸的插手不会刺激PMLA的堆集[161。 1.3.2葡萄糖浓度对PMLA发酵的影响 葡萄糖初始浓度跨越509,L时,再添加其浓度不会添加PMLA的产量。葡 萄糖初始浓度在259/L时,PMLA的发生只发生在较短的一个期间,而且产量显 著削减。因而,出产PMLA的最适葡萄糖浓度该当为509/Ltl6】。 1.3.3接种量对发酵的影响 接种量决定出产菌种在发酵罐中的繁衍速度,采用大的接种量能够缩短发酵 罐中菌体发展到高峰的时间,使产品的构成提前到来,还有益于削减杂菌发展的 机遇,但若是接种量太多,会使菌体发展加速,培育液黏度添加,形成消融氧不 足,而影响产品的合成。 据刘双江【16】等的文献报道,以l%种量接种发酵罐,2L发酵罐中插手1000ml 培育基,20L发酵罐中插手15L培育基。 1.3.4温度对发酵的影响 微生物的发展和产品的合成都是在各类酶的催化下进行的,温度是包管酶活 性的主要前提,因而在发酵系统中必需包管不变而合适的温度情况,要选择一个 既适合菌体发展,又适合出产的温度,别的还要按照具体的发酵前提进行改变。 影响发酵温度的要素:生物热,搅拌热,蒸发烧,辐射热。 温度对发酵的影响:①从酶动力学来看,温度升高,反映速度加大,发展代 谢加速,出产期提前,但酶会因热而失活,温度越高,失活越快,表此刻茵体易 衰老,发酵周期缩短,影响产品的最终产量。②温度除了间接影响发酵过程中的 各类反映速度外,还通过改变发酵液的物理性质,间接影响菌的生物合成。③温 度有时还影响生物的合成标的目的。 刘双江【16】等以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)别离在20C、25C、 30℃下发酵,发觉菌体的发展和聚苹果酸的生成在25℃下达到最高,温度高于 25(2晦气于菌体发展和聚苹果酸的生成。 1.3.5溶氧对发酵的影响 7 第一章文献综述 好氧性微生物需要适量的消融氧来维持其呼吸代谢和代谢产品的合成。对多 数发酵来说,氧的不足会形成代谢非常,产量降低。出芽短梗霉的发酵过程具有 两个较着的耗氧峰值,申明菌体发展和胞内代谢物的释放并分歧步进行,代谢物 在胞内堆集到必然程度才向外释放,跟着向胞外释放,细胞代谢加剧构成另一个 耗氧高峰【261。若能在代谢物在胞内堆集初期,采纳某些手段促使其敏捷向胞外释 放,削减其在胞内的堆集,将可能提高产量,并无效缩短发酵周期,降低成本。 改变DO能显著影响菌株对糖的操纵。DO过低时,糖的操纵速度和操纵率低, 菌体生物量和多糖产量就低;DO增大时,糖的操纵速度和操纵率都增大,但过 高的DO更利于菌体的发展,从而耗损掉大量的养分基质,形成资本华侈。因而 维持合适的DO对节约成本提高多糖产量尤为主要。 提高消融氧的方式:①通纯度高的氧气。②提高罐压,但可能会影响温度, pH,对设备的要求也高。③通过搅拌来添加溶氧,还能改善罐内液体的夹杂和 轮回,从而具有抑止气泡聚合的结果,使氧气平均的消融于发酵罐中。但搅拌速 率过快,机械切向力可能会粉碎菌体。④在发酵答应的范畴内恰当的提高温度。 1.3.6搅拌对发酵的影响 搅拌次要是为了添加消融氧,使氧气平均的具有于发酵液中,避免死角的存 在。搅拌速度要适中,一方面要满足消融氧的需要,另一方面不克不及因过快影响菌 体的发展。 据刘双江【16】等的文献报道,2L发酵罐的运转前提是:温度节制25℃,搅 温度节制25℃,搅拌速度为400r/min,通气量4.0L/min。 1.3.7 pH对发酵的影响 发酵过程中的pH是微生物在必然情况下代谢的分析目标,对菌体的发展和 产物的堆集有很大的影响。每一类菌都有其最适的和能耐受的pH范畴。大大都 细菌发展的最适pH为6.3~7.5;霉菌和酵母菌发展最适pH为3~6;放线。微生物发展和产品合成阶段的最适pH往往纷歧样,这不只和菌种的特 性相关,也取决于产品的化学性质。pH的变化会惹起各类酶活力的改变,影响 菌对基质地操纵速度和细胞地布局,影响菌体的发展和产品地合成,还汇合成菌 体细胞膜电荷情况,惹起膜的渗入性地变化,因此影响菌对养分的接收和代谢物 硕士学位论文 的构成。尝试表白p卅,在发酵的起头阶段,pH下降得很敏捷,过酸地情况不适 宜菌体地发展和出产,一般采犀Jcac03调理pH,使发酵过程中的pH维持在一个 适宜的范畴内。别的发酵的初始pH也对发酵有主要的影响,这不只影响到发酵 初期菌体的发展情况, 也会影响到后期发酵过程中pH值的动态变化和菌体的聚 苹果酸合成的能力。 刘双江等【31】以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)别离在pH2.0、4.0、5.5 下发酵,发觉聚苹果酸的生成量和葡萄糖的耗损量在pH4.0时达到最高,在pH 2.0、5.5时菌体发展优良,可是葡萄糖耗损量较着削减,聚苹果酸生成量也削减。 通过加2.5mol/L NaOH不竭调理培育基的pH值。 1.3.8泡沫节制对发酵的影响 在微生物的发酵过程中,发酵液会发生必然数量的泡沫,容易惹起逃液现象, 惹起良多副感化:降低发酵罐的装料系数,添加了菌群的非均一性,添加了染菌 几率,导致产品的丧失,影响一般搅拌和通风。目上次要用的消沫方式无机械法 和消沫剂消沫。常用的消沫剂有天然油脂,聚醚类,高级醇类和硅酮类。 据刘双江等的文献报道,发酵罐内有泡沫时能够插手硅树脂防沫剂【31,16]。 1.3.9基质浓度对发酵的影响及补料节制 过高的基质浓度会惹起分化代谢物阻拦现象,并障碍了产品的构成;过低的 浓度不克不及不克不及满足产品合成的需要,菌体发展迟缓,生物合成慢。为领会除基质 过浓的抑止,产品的反馈抑止和葡萄糖分化阻拦效应,以及避免一次性投糖过多 形成细胞大量发展,耗氧过多而供氧不足的环境,一般采用两头补料的方式,常 用的方式是在发酵到预按时间,按照基质的耗损速度和残留基质浓度,取必然量 的添加物,加到发酵液中。跟着研究地的成长,就补料的体例而言,有持续流加 和变速流加,按照分歧地环境选择最合适的补料体例。 1-3.10概况活性剂对发酵的影响 概况活性剂通过改变细胞膜的通透性促使发酵产品更多的释放,有时还能够 缩短发酵的周期和削减发酵过程中的能量耗损。例如,在短梗酶发酵多糖中,添 80 加Tween0.05%时的结果比力好,与不添加概况活性剂比拟多糖产量提高25 %摆布,发酵周期缩短了快要2d。 1.4聚苹果酸的提取方式 9 第一章文献综述 1.4.1无机溶剂沉淀法 沉淀法是通过改变前提或插手某种沉淀剂,使溶液中的溶质由液相改变为固 相析出的过程,是一种最陈旧和最常用的生物物质分手和纯化的方式。因为其浓 缩的感化大于纯化的感化,所以常被用作初步分手的一种手段,从颠末预处置并 过滤除去了菌体碎片等的发酵液中,沉淀获得生物物质,然后再做进一步的纯化。 沉淀法具有成本低、收率高、设备简单、浓缩倍数高和操作简单等长处。 南开大学宋存江等操纵无机溶剂沉淀法从发酵液中提取出聚苹果酸纯品【35】。 具体方式如下: 发酵竣事后离心,固液分手,除去菌体;将发酵液调理pH至5,插手等体 积乙醇,黑色絮状沉淀即为吸附了黑色素的普鲁兰,淡黄色澄清液即为聚苹果酸 溶液;过滤分手:将聚苹果酸溶液浓缩后再加二倍体积乙醇,呈现的少量絮状沉 淀为普鲁兰,二次旋蒸浓缩上清液,获得较为纯化的聚苹果酸浓缩液;将浓缩液 加四倍体积乙醇,至于4c冰箱留宿,有白色沉淀析出,再次溶于50.100倍分量 的水中,透析或超滤2天,去除聚苹果酸中的黑色素和一些小分子物质,冷冻干 燥,得聚苹果酸白色粉末状产品。 Lee博士等[2】在《水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸》一书中曾提 Bong.Seop 到,聚苹果酸钙盐是通过在过量的CaC03或贫乏CaC03的环境下用甲醇频频沉 淀而分手。钙盐再通过Amberlite120(一)转化为酸、冻干,在温热(30-40℃) 的丙酮中从头消融后离心,减压去除溶剂后就能够获得高纯度的玻璃状结晶,即 聚苹果酸。 1.4.2膜分手法 膜分手手艺是一项新兴的高效分手手艺,是用天然某人工合成的高分子膜, 以外界能量或化学位差为鞭策力,对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分手、分 级、提纯和富集的方式。此手艺具有分手效率高、分手前提暖和、流程简单、能 耗低及它的规模和处置能力可在很大范畴内变化,而它的效率、设备价钱、运转 费用等都变化不大等。 聚苹果酸钠盐和钾盐是采纳阴离子互换色谱分手获得,流动相是KCl或 G25而除去的。冻干样品是无定型、无色的粉 NaCI,过量的盐是通过Sephadex 末、浆状物和玻璃状物。 10 硕士学位论文 由Physarum 以操纵图1-1的流程进行,20L的发酵液能够提取209纯聚苹果酸[36’29,371。 pur蒯田 p蠲盼吣DE^[捌m赠,eIhanDIp帕c触a蛄0n 2Dlfe咖enc{jtion0f p01]f喊 gluco蛹is20q● - ■- 一 图1.2聚苹果酸的提取流程图 I-2 and ofPMLAfrom Fig productionpurification Physarumpolycephalum 1.5聚苹果酸的定性与定量方式【38’39I 目前定量检测聚苹果酸的方式次要局限于将其水解为苹果酸,所以在聚苹果 酸的提取和测定过程中还有必然的不精确性。 1.5.1酶法: 1.5.1.1道理: 聚苹果酸是以苹果酸为独一单体的,所以能够将聚苹果酸降解为苹果酸再对 苹果酸进行检测。对苹果酸的检测是采用酶法进行的 酸解 苹果酸脱氢酶 聚苹果酸———◆苹果酸———————◆草酰乙酸-I-NADH 或碱解 NAD+ (1)光度计检测,NADH在340纳米处有检 NADH能够有两种方式来检测: 测光接收,检测最低值为l微克。 (2)荧光激发,激发波长为455纳米,检测最 第一章文献综述 低值为0.1微米。 1.5.1.2操作方式: 波长:340nm,1cm石英比色皿 温度:20-25℃ 样品中苹果酸的含量节制在2.20毫克 试剂1:0.05M甘氨酰甘氨酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液或甘氨酸.NaOH缓冲液 pill0.0,每30ml含L-谷氨酸440毫克及不变剂。 试剂2:NAD冷干粉210mg,利用前N入6ml蒸馏水消融 试剂3:谷草转氨酶悬浮液 试剂4:L.苹果酸脱氢酶溶液 具体方式如表所示: 表1.1酶法测聚苹果酸的流程 Table1-1theflow measurementmalicacid ofenzymatic ofpoly 用移液管插手 空白 样品 试剂l 1.0ml 1.0ml 试剂2 0.2ml 0.2ml 蒸馏水 1.0ml 0.9ml 试剂3 0.01ml 0.01ml 样品溶液 一0.1ml 混匀约3min后,读取空白及样品吸光度AI,插手试剂4 试剂4 0.01ml 0.01ml 混匀代反映完成后(约5.10min),当即顺次读取空白及样品吸光度A2 计较空白样品的吸光度差A2.Al,并计较出AA=AA样品.△A空白 样品中L.苹果酸浓度为 V母M宰W C= ·△A E幸d木v毒1000 注:V:反映系统终体积ml 12 硕士学位论文 M宰w:L·苹果酸摩尔质量g/mol v:样品体积ml d:光径cm e:NADH在340nm处的吸光系数6.3 1.5.2L.苹果酸酶试剂盒法 该方式也是操纵聚苹果酸降解为L.苹果酸,然后再对L.苹果酸进行测定的方 法。 体积的Imol/L硫酸,90(2水解留宿。采用L-苹果酸酶试剂盒别离测定发酵液水解 前后的苹果酸浓度,二者之差即为发酵液中聚苹果酸的浓度。水解前发酵液中苹 果酸的浓度一般不跨越0.02ecL。 1.5.3定量纸层析法’ 聚苹果酸的寡聚物和它们的衍生物能够通过定量纸层析法来判定和定量。具 体操作方式为:采用微量打针器将样品定量点样在新华3号滤纸上,以正丁醇: 甲酸:水:4:1.5:1的夹杂液为展开剂进行纸层析,然后用0.02%的溴甲酚绿显 色剂喷雾显色。剪下已显色的L.苹果酸黑点,至于5ml去离子水中,洗脱3h。 取lml过滤后的洗脱液,插手6ml96%的硫酸和O.1mlO.1%的OL.奈酚溶液混匀, 含量。 1.5.4反相高效液相色谱法 动相。样品颠末处置后,注入反相化学键合相色谱系统,样品中无机酸在两相中 分派分手,按其碳原子数分歧由少到多从柱中流出。因为聚苹果酸在205nm处有 紫外接收,所以流出液能够经紫外检测器或示差折光检测器测定后与尺度比力定 量。 1.5.5凝胶渗入色谱法 聚苹果酸的分子量和多分离性因子能够通过在0.2mol/L的磷酸缓冲液(或 0.1M柠檬酸/四氢呋喃溶液)的凝胶渗入色谱来测定,利用的分子量尺度是聚乙 二醇或者聚苯乙烯磺酸。 第一章文献综述 1.5.6核磁共振测定法: 对聚苹果酸采用1HNMR和13CNMR法进行标识表记标帜。核磁共振的分光计采用 BrukerARX300,以四钾硅烷为内标物。将光谱图与尺度的进行对照从而得出含 有的基团,从而得出聚苹果酸得布局。 例如:用1H NMR标识表记标帜法对c【,p.聚苹果酸测定的部门核磁共振图谱为: ..上 JJI。 …一。. / 一\ 一个a,p.聚苹果酸的完整的13CⅫⅥR法的核磁共振图谱为: 160 130 100 70 40 由此便能够得出其布局式为: 硕士学位论文 0【型 p型 O ¨H C—CO 2一 气 I oi(!)4 J * 1宁2∞№: 2长I∞ 上√ COOH 5 1.5.7红外光谱法 360 利用Nicolet FT-IR傅立叶红外光谱仪作物质的红外图谱,∥.PMLA(kBr) 4000 2咖 V啊删rrl呐一fem-I 上述几种定量阐发方式中,L.苹果酸酶试剂盒法和定量纸层析法操作简单, 速度较快,但阐发精度不是很高。反相高效液相色谱法,主动化程度高,反复性 好,活络度高,可是为了庇护色谱分手柱,样品一般都需要预处置,阐发成本高, 不适于多量量阐发。 1.6本论文的研究意义和研究内容 1.6.1研究意义 聚苹果酸(PMLA)是一种完全生物可降解性高分子,降解产品无毒无害, 不会对情况发生二次污染,因而,这种高分子材料的开辟研究近年来获得高度关 注和飞速成长。聚苹果酸在医药、食物包装材料、吸水材料、化妆用品等范畴具 有广漠的使用前景,而且p.聚苹果酸有和13.聚羟基脂肪酸酯相关的很是吸惹人的 功能构成,将来可能发觉它的新的使用,好比能够制备优秀的可降解塑料,处理 当前风险严峻的“白色污染问题,以至能够取代石油来历的不克不及被生物降解的 聚丙烯酸的短期使用[40】。能够意料,聚苹果酸作为新型功能材料和生物布局材料 第一章文献综述 定会获得很大的成长。 微生物发酵法制备聚苹果酸所得产物的分子量较高,所需的原料简单易得, 产品较纯,反映前提暖和。但到目前为止,对微生物合成PMLA的研究较少,分 离获得的菌种也很少。而且因为菌种的不变性和产酸能力的缘由,发酵法尚未形 成财产规模。因而,微生物发酵法出产PMLA有待于优秀菌种的选育及发酵工 艺的完美,为此后更大规模的放大和出产工艺的制定供给有益的支撑和根据。 1.6.2研究内容 本课题次要是在曾经对摇床发酵产聚苹果酸进行了初步研究的根本上,操纵 摇床得出的最优培育基及培育前提为起点,本课题的研究目标次要是提高发酵 罐中聚苹果酸的产量,通过改变发酵的培育基、培育前提及培育体例等实现。在 提高产量之后,还要进一步对聚苹果酸的提取和使用进行研究。 次要分为以下四个部门: (1)对发酵罐发酵聚苹果酸的培育基及培育体例进行优化,次要包罗分歧 氮源及其浓度、微量元素、无机酸和分歧补料体例对聚苹果酸发酵的影响。 (2)对发酵罐发酵聚苹果酸培育前提进行优化,次要包罗接种量、搅拌、 通气量、温度和恒溶氧对聚苹果酸的影响。 (3)对聚苹果酸的提取方式进行优化,次要包罗无机溶剂的选择、pH对沉 淀的影响、温度对沉淀的影响及多步沉淀等。 (4)聚苹果酸的表征,次要包罗布局和分子量简直定。 16 硕士学位论文 第二章聚苹果酸发酵培育基的优化 2.1媒介 培育基是微生物发展和构成代谢产品的物质根本,在包管微生物机体发展需 要的同时,又要有益于代谢产品的合成,因而必需考虑培育基的构成和浓度,以 尽量避免因为培育基的不妥利用惹起的分化代谢阻拦。出芽短梗霉具有复杂的生 活史,短梗霉PMLA的生物合成也是一个极其复杂的、动态的、受多种要素影 响的过程。在发酵过程中培育基成份和发酵前提是间接影响发酵产量的次要因 素,本文拟通过氮源、微量元素和无机酸的选择来开展聚苹果酸发酵培育基的优 化。 2.2尝试材料与方式 2.2.1菌种 出芽短梗霉AureobasidiumpullulanBS04,由本尝试室筛选保藏。 2.2.2培育基 斜面培育基(g/L):马铃薯葡萄糖琼脂培育基(-B铃薯200,葡萄糖20,琼 脂20) MgS04·7H200.1,ZnS04‘7H200.005,玉米浆0.5,pH4.5。 ZnS04·7H200.005,CAC033(零丁灭菌),pH4.5。 2.2.3仪器与设备 表2.1尝试仪器及设备 Table2—1 and of Apparatusequipmentsexperiment 17 第二章发酵罐发酵聚苹果酸培育基的优化 2.2.4尝试试剂 表2-2尝试试剂 Table2-2 of Reagentsexperiment 硕士学位论文 2.2.5尝试与阐发方式 2.2.5.1种子液的制备 将保具有PDA培育基上的菌种接种至种子培育基中(100ml/500ml三角摇 瓶),25℃,220r/min,培育72h。 2.2.5.2发酵培育 采用7.5L发酵罐,装入发酵培育基,装液量5L,发酵罐120℃摆布灭菌20分 钟,培育前提:接种量为4%,培育温度25℃,通气量为3.5L/m,搅拌转速为 体发展量的测定,尝试竣事后同一进行产量及残糖的测定。 2.2.5.3菌体发展量的测定方式 采用比浊法,微生物的发展惹起培育物混浊度的添加,通过紫外分光光度计 测定特定波长下的吸光度,从而判断微生物的发展情况。本尝试采用640nm的波 长进行测定。因为尝试中有碳酸钙的插手,所以在测吸光度之前要先将碳酸钙处 理掉,具体的操作方式为:取夹杂平均的发酵液10mL,插手8mLlN的HCl,搅 拌至没有气泡发生,再将其稀释lO倍,于640nm波利益测吸光度。 2.2.5.4残糖测定方式 清液,测定其各个时间段下的残糖量。 2.2.5.5L.苹果酸的测定方式 液各2mL(记为I、2样),此中一份(样I)加等量的浓硫酸于80℃下水解两小 时,得样3,将样2和3各稀释250倍,别离取lmL,并另取lmL蒸馏水作为对照(记 再在390nm下测吸光度。在操纵尺度曲线计较出苹果酸的浓度,两者之差就是聚 苹果酸水解成的苹果酸的浓度。 第二章发酵罐发酵聚苹果酸培育基的优化 2.2.5.6聚苹果酸的测定方式 通过检测出L.苹果酸浓度计较出聚苹果酸的浓度。 2.3成果与会商 2.3.1分歧氮源对聚苹果酸发酵产量的影响 氮源和碳源一样也是微生物的次要养分物质,次要形成细胞布局物质,如氨 基酸、卵白质和核酸等;合成含氮代谢产品;在碳源不足的时候,微生物也能够 操纵氮源,所以拔取合适的氮源对菌体的发展十分环节。常用的氮源有两大类, 即无机氮源和无机氮源。常用的无机氮源如黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、卵白 胨、尿素等。无机氮源除含有丰硕的卵白质、多肽和游离的氨基酸外,还含有糖 类、脂肪、无机盐、维生素及某些发展因子,因此微生物在含无机氮的培育基中 表示出发展兴旺、菌丝浓度发展敏捷的特点。本论文次要选用分歧的无机氮源进 行尝试,成果如图2-l所示。 30 25 20 一 ≥15 删 k 10 5 0 空白 玉米浆 酵母青 黄豆饼粉卵白胨尿素 图2.1分歧氮源对聚苹果酸产量的影响 2-1Effectofdifferent onthe ofPMLA soQrce Fig nitrogen yield 由图能够看出,几乎所有的氮源对出芽短梗霉发酵产聚苹果酸都具有推进作 用,此中玉米浆的感化最为较着。玉米浆是一种复合氮源,除了含有微生物发展 所必需的氮源外还有很多有益于微生物发展的微量元素等,并且玉米浆的价钱便 宜,有益于工业化时节约成本,所以考虑在发酵培育基中插手玉米浆以提高聚苹

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